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    PCR試劑盒實驗的注意事項

    發布時間:2022-06-30    點擊次數:66

      PCR試劑盒實驗的注意事項


      PCR試劑盒實驗的注意事項,本生(天津)健康科技有限公司供應:移液器吸嘴,ELISA試劑盒,動物血清,全系熒光定量PCR耗材,產品包括:PCR單管、八聯管、96孔板、384孔板。

      

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      PCR實驗要注意以下幾點:

      1. PCR引物設計:

      引物設計可能是PCR擴增成功zui關鍵的因素。如引物設計欠佳,可能導致擴增產物不足,甚至擴增失敗,其原因是設計欠佳的引物可導致非特異擴增和/或形成引物二聚體,此又成為PCR反應的競爭性產物,從而進一步抑制PCR產物形成。

      在引物設計時必須考慮以下幾個因素,其中zui重要的是引物長度、溶解溫度(Tm)、特異性、引物序列互補問題、G/C 含量和多嘧啶(T,C) 或多嘌呤(A, G)延伸、3’-末端序列等。

      (1)引物長度:由于PCR反應的特異性、退火溫度以及時間均至少部分與PCR引物長度相關聯,因此引物長度是PCR擴增是否成功關鍵的因素。一般PCR引物長度為15-30核苷酸。

      (2)溶解溫度(Tm):因加熱而斷開H鍵,使雙鏈DNA分開或“溶解"為單鏈DNA。溶解溫度(Tm)即指使一半雙鏈DNA變為單鏈DNA的溫度。Tm可采用下列公式計算:Tm=2(A+T) + 4(G+C)。

      需注意PCR反應至少有兩個(一對)引物,兩個寡核苷酸引物Tm 值應比較接近,不可差異過大。因有較高的Tm值的引物在較低的反應溫度時可發生錯配,而引物Tm值較低,反應溫度較高時則可能不能發生作用,因此如引物的Tm值差異較大,可導致PCR擴增效率低下甚至擴增失敗。

      (3)引物序列互補:設計引物時應沒有3個堿基以上的內引物配對,如引物有這樣具有自我配對的區域,“彈回"即部分雙鏈結構將發生在退火反應時。

      (4)G/C 含量和多嘧啶(T,C) 或多嘌呤(A, G)延伸:待選擇的引物序列應盡可能是堿基隨意分布,G+C含量平均-避免長A+T和富含G+C的區域。在引物的堿基組成中GC含量一般為45%-55%。在選擇的引物序列中應沒有多G 或多C延伸,因其可促進非特異性退火,多A 和多T延伸也應避免,因其可“呼吸"和使引物-模板復合物展開延伸,降低擴增的效率。同時多嘧啶(T,C)和多嘌呤(A,G)延伸也應被避免。

      (5)3’-末端序列:為控制引物錯配,應認真地確定PCR引物中3’末端的位置。

      總而言之,應重視PCR引物設計,設計PCR引物時應認真小心。對于一個成功的PCR來說,幾個重要因素如引物長度、GC含量和3’序列必須優化。理想的引物應為差不多隨意分布的核苷酸混合、GC含量50%、長度約為20個堿基,因此能使Tm值處于56-62oC范圍。分析靶基因潛在引物位點時,應考慮無單聚合體, 沒有明顯的二級結構形成的傾向,不自我互補,與其他雙鏈靶基因序列沒有明顯的同源性。為避免枯燥無味的設計,節省時間,減少錯誤,可應用計算機程序優化設計、選擇、確定寡核苷酸引物。

      PCR試劑盒實驗的注意事項本生一直視質量控制為企業的生命,追求企業競爭力的不斷提升。公司在經營中始終秉承:遵紀守法,嚴于律己,寬仁以待,敢于承擔的企業精神作為標準,以過硬的質量和優良的服務來維護和拓展市場,較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏,是我們的發展目標。本生!您信任的合作伙伴。我們愿與您真誠合作,共創美好的未來。


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