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    熒光定量PCR耗材如何使用及選擇需注意事項 !

    發布時間:2022-06-20    點擊次數:74

      本生生物詳解:高通量的96孔PCR板和8聯管是在聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction ,PCR)中,主要作為參與擴增反應的引物、Taq DNA聚合酶、dNTP、模板核酸、Mg、緩沖液等的承載物。醫療級聚丙烯(PP)材質因其極高的純凈度和穩定性,能更好適應PCR反應過程中反復高低溫設定,并且能夠實現高溫高壓滅菌操作,常常被用于PCR耗材的生產。隨著熒光定量PCR技術的普及,該技術被廣泛用于遺傳、生化、免疫、醫藥等領域,不僅應用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎研究,還可用于疾病的診斷或任何有DNA,RNA的研究領域。

      如何正確使用96孔PCR孔板?

      >PCR板有透明和乳白色可選,其中乳白色更適合用于頂部采集熒光信號的新型熒光定量PCR儀(如伯樂CFX系列,ABI 7500fast 以上型號, Roche 480系列),但如果熒光定量PCR儀是底部光源的,則應選擇透明的。

      >PCR板根據裙邊設計又可分為無裙邊、半裙邊和全裙邊三種設計模式,不同廠家的熒光定量PCR儀會設計不同的切角或邊緣凸起,請選擇適合該PCR儀的板子。

      >PCR板又分100ul體積(矮板)和200ul體積(高板),根據機型的不同選擇,選擇不同高度孔板,避免高度錯誤對機器造成破壞和加熱不均導致數據失真。

      >當使用96孔板做熒光定量PCR實驗的時候,推薦使用光學膜代來密封反應孔。正確的封膜方法是:先沿著96孔板的縱向壓膜,然后橫向,最后沿著板的邊緣按壓使之密封。具體手法見下面圖示:

      加樣后會在管壁上飛濺一些小液滴,另外反應體系內也會有一些氣泡,需要離心去掉掛壁液滴和氣泡。請使用專用的微孔板離心機解決上述問題。

      PCR板屬于一次性消耗品,生產一次成型,不建議剪開使用容易造成實驗誤差增加,不能清洗或部分重復利用。不要為了節省一點小錢,而給實驗帶來后續分析上的困擾。

      樣本量少,用8聯管做實驗又該注意哪些呢?

      >8聯管也分乳白和透明兩種,選擇方式和孔板一樣,根據PCR儀的熒光信號采集方式決定。

      >8聯管同樣也有0.1ml(矮管)和0.2ml(高管),根據PCR儀的加熱模塊體積確定。


      >8聯管的蓋子一般有光學平蓋和凸型圓蓋之分,光學平蓋適用于熒光定量PCR,圓蓋適用于普通PCR。

      >使用單管或8聯管做實驗,并且樣本數量不多的時候,建議在樣品加熱塊(TRAY)上對稱地安放樣品,最好是縱向放置,并且優先放在第6列或第7列,然后逐漸向兩邊放置。這樣做的好處是熱蓋壓下來的時候不至于發生傾斜,各個反應管的受力和受熱都比較均勻,提高孔與孔之間的數據精密性。也可以在加熱模塊四角的位置,放置4個單管平衡熱蓋壓力,避免擴增少量樣本時出現管子變形的情況。

      >管蓋沒有蓋好造成PCR反應液熱蒸發,影響反應溫度的準確控制及反應也各成份的濃度,同時也成為一個污染源。不但會因壓蓋時由于粗心或者用力不均致使部分蓋子變形,而且還會造成樣品的交叉污染,所以我們推薦用獨立管蓋的8聯管,每管蓋一體,確保樣本獨立反應,避免交叉污染。


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